Nuovi sistemi CRISPR scoperti, migliorando la precisione dell’editing genetico

Cosa ci rende unici? Diversi dalla maggior parte, ma simili a pochi? Cosa plasma la nostra costituzione fisica, comportamentale e persino mentale? La risposta risiede nei nostri geni.

Trasferiti dai genitori alla prole, i geni contengono le informazioni che specificano le caratteristiche fisiche e biologiche.

Ma non è tutto. I geni sono anche responsabili delle malattie. Geni difettosi possono causare ogni tipo di problema che può manifestarsi come difetti congeniti, malattie croniche o problemi di sviluppo.

Un modo altamente avanzato per affrontare ciò è l’editing genico o del genoma, che consente agli scienziati di apportare modifiche precise al DNA. L’editing genico prevede l’aggiunta, la rimozione o la modifica del materiale genetico in posizioni specifiche.

Queste modifiche specifiche e mirate al DNA possono portare a cambiamenti nelle caratteristiche fisiche o nel rischio di malattie. 

Questa tecnologia non è solo utilizzata per trattare malattie genetiche correggendo geni difettosi, ma anche per sviluppare nuovi trattamenti e approfondire la comprensione della funzione genica. Inoltre, può migliorare le colture apportando modifiche precise al loro DNA. Una tecnologia di editing genico ben nota e ampiamente utilizzata è CRISPR-Cas9, basata su un sistema di difesa batterico naturale.

CRISPR-Cas9 deriva da CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), un sistema immunitario batterico che aiuta i batteri a difendersi dalle infezioni virali riconoscendo e distruggendo il DNA virale. 

In questo sistema, CRISPR funge da dispositivo di oming genetico, mentre Cas9, una proteina, agisce come “forbici” molecolari per tagliare il DNA in siti specifici. È più semplice, più economico e più preciso rispetto alle tecniche di editing genico precedenti. 

Un metodo di editing del genoma basato sulla tecnologia CRISPR-Cas9 è stato effettivamente premiato con il Premio Nobel per la Chimica nel 2020. È stata la prima volta nella storia che un premio Nobel è stato assegnato a due donne.

CRISPR: Trasformare la biologia moderna con l’editing genetico

CRISPR è stato identificato per la prima volta qualche decennio fa. Nel 1987, Yoshizumi Ishino e il suo team dell’Università di Osaka lo osservò nei genomi batterici (E. coli). Tuttavia, solo all’inizio degli anni 2000 è stato identificato il ruolo di CRISPR come immunità batterica.

Negli ultimi anni, questa tecnologia è progredita notevolmente ed ha trasformato la biologia moderna.  

Un esempio di ciò è l’uso di CRISPR–Cas9 per modificare le cellule di embrioni umani, consentendo che le modifiche genetiche vengano trasmesse alle generazioni future. Questo è stato ampiamente disapprovato, con richieste di vietare le modifiche genetiche ereditabili.

Oltre a ciò, CRISPR–Cas9 e le tecnologie correlate sono anche utilizzate con successo per curare malattie potenzialmente letali. 

Nei primi tre mesi di quest’anno, diversi ricercatori hanno utilizzato CRISPR per raggiungere numerosi progressi.

All’inizio di questo mese, un team di scienziati di Colossal Biosciences ha creato dei ‘topi lanosi’ — topi con pelliccia lunga simile al mammut lanoso estinto. Lo hanno fatto modificando simultaneamente sette geni legati alla crescita dei peli, al colore e alla consistenza.

Il team sta lavorando su diversi progetti di de-estinzione, tra cui il tilacino e il dodo, con il mammut come progetto di punta. Tutti questi progetti prevedono l’uso di cellule staminali di una specie strettamente correlata a quella estinta e poi la modifica basata sui genomi della specie scomparsa. Per questo, i ricercatori hanno utilizzato varianti dei sistemi CRISPR/Cas9 e CRISPR/Cas.

Il mese scorso, scienziati del McGovern Institute for Brain Research del MIT e del Broad Institute of MIT and Harvard hanno scoperto¹ un antico sistema guidato da RNA che può espandere la cassetta degli attrezzi dell’editing del genoma e semplificare la somministrazione delle terapie di editing genico.

Questi sistemi, chiamati TIGR (Tandem Interspaced Guide RNA), possono essere riprogrammati per mirare a qualsiasi sequenza di DNA. Possiedono anche moduli funzionali distinti che agiscono sul DNA bersaglio. Oltre alla sua modularità, TIGR è altamente compatto.

Secondo Feng Zhang, professore di Neuroscienze al MIT, il cui team in precedenza ha adattato i sistemi CRISPR batterici in strumenti di editing genico e ha scoperto vari proteine programmabili:

“Questo è un sistema guidato da RNA molto versatile con molte funzionalità diverse.” 

Nel loro ultimo lavoro, il team si è concentrato su una caratteristica strutturale della proteina CRISPR-Cas9 che si lega alla guida RNA dell’enzima. Hanno scoperto oltre 20.000 diverse proteine Tas, sperimentato decine di esse e dimostrato che alcune possono essere programmate per effettuare tagli mirati al DNA nelle cellule umane. Ora stanno pianificando di sviluppare i sistemi TIGR-Tas in strumenti programmabili.

Gli scienziati stanno persino esplorando l’editing genico per correggere la trisomia a livello cellulare. Recentemente hanno rimosso con successo copie extra del cromosoma 21 in linee cellulari della sindrome di Down usando CRISPR-Cas9, ripristinando l’espressione genica normale.

La sindrome di Down si verifica quando c’è una copia extra del cromosoma 21. Questa condizione colpisce circa 1 su 700 nascite vive e, sebbene sia facilmente diagnosticata precocemente, attualmente non esistono trattamenti.

Ma l’ultimo progresso, ottenuto in cellule coltivate in laboratorio, è riuscito a rimuovere il cromosoma extra dalle linee cellulari di trisomia 21, derivate sia da cellule staminali pluripotenti sia da fibroblasti cutanei, lasciando una sola copia da ciascun genitore invece di due identiche.

Sebbene non sia pronta per l’uso in organismi viventi, suggerisce un potenziale per l’applicazione nei neuroni e nelle cellule gliali.

In un altro caso, scienziati cinesi hanno costruito un sistema di editing genico più sicuro usando virus mortali come la febbre dengue per migliorare l’efficienza e la sicurezza. Il sistema utilizza mRNA per evitare il rischio che DNA estraneo rimanga e crei mutazioni indesiderate.

Secondo il team di ricerca, il sistema di consegna di mRNA ottimizzato “aumenta la flessibilità e l’applicabilità dell’editing del genoma senza transgene nelle piante.”

Quindi, la tecnologia di editing genico ha rivoluzionato non solo la biologia umana ma anche l’agricoltura modificando il DNA delle piante per migliorare tratti desiderabili come rese elevate.

Proprio questo mese, scienziati della Johns Hopkins University e del Cold Spring Harbor Laboratory hanno scoperto i geni chiave che determinano la dimensione dei frutti. Questi geni possono essere controllati con CRISPR, aprendo la strada a prodotti più grandi e più saporiti.

La ricerca fa parte di un’iniziativa più ampia per mappare i genomi completi di 22 colture della famiglia delle Solanacee, tra cui patate, melanzane e pomodori, per comprendere e migliorare i loro tratti genetici.

“Una volta effettuato l’editing genico, basta un seme per avviare una rivoluzione.”

– Co-lead author Michael Schatz, genetista presso la Johns Hopkins University

Tutti questi sviluppi mostrano quanto la tecnologia sia progredita, ma è solo l’inizio. Ricercatori della Duke University e della North Carolina State University hanno ora scoperto nuovi sistemi CRISPR-Cas che migliorano ulteriormente le capacità delle tecnologie di editing genico esistenti.

Clicca qui per saperne tutto su CRISPR-Cas9. 

Advancing CRISPR: Nuovi sistemi aumentano la precisione dell’editing genetico

Da quando i sistemi CRISPR-Cas sono stati scoperti per la prima volta nei batteri, sono stati identificati numerosi ortologhi. Gli ortologhi sono geni evoluti da un gene ancestrale comune attraverso un evento di speciazione. Sono presenti in specie diverse e potenzialmente mantengono la stessa funzione.

Sono stati caratterizzati almeno sei tipi e 33 sottotipi di ortologhi, ma nonostante ciò, i sistemi di tipo II sono i più ampiamente usati nella biotecnologia e nella ricerca biomedica. Questi sistemi di tipo II usano Cas9 per tagliare il DNA.

La facilità di riprogrammare i siti target di Cas9 lo ha reso così popolare e ha inaugurato un’ondata di potenziali terapie di editing del genoma.

Tuttavia, nonostante l’abbondanza di sistemi batterici CRISPR-Cas9, pochi sono efficaci nelle cellule umane, limitando il potenziale complessivo della tecnologia CRISPR.

Ciò crea la necessità di ulteriori ortologhi di Cas9 per ampliare la gamma di sequenze di DNA targetizzabili. Questo aiuterà anche a superare le limitazioni di dimensione della consegna e a migliorare la specificità e l’efficienza dell’editing genico CRISPR-Cas9.

Quindi, i ricercatori della Duke University e della NC State University hanno esplorato migliaia di genomi batterici alla ricerca di nuovi sistemi CRISPR-Cas e hanno scoperto alcuni che possono essere aggiunti alla cassetta degli attrezzi dell’editing genico.

Lo studio, pubblicato su Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS)² questo mese, espande efficacemente l’impatto della tecnologia sulla ricerca, sulla medicina e sulla biotecnologia.

“È davvero sorprendente che i primi sistemi CRISPR-Cas che i ricercatori hanno usato sulle cellule umane siano ancora quelli che funzionano meglio. Volevamo setacciare batteri trovati in ambienti più oscuri alla ricerca di diversi sistemi CRISPR che potessero avere capacità differenti.”

– Charlie Gersbach, professore di Ingegneria Biomedica alla Duke

Tra i genomi batterici appena scoperti, un particolare sistema derivato da batteri, tipicamente presenti nelle mucche da latte, mostra promettenti potenzialità per la salute umana.

Questo effetto ortogonale consente un targeting complementare e flessibile di sequenze genetiche diverse per l’editing del genoma di nuova generazione.

Il sistema è anche altamente efficiente, comparabile al diffuso Streptococcus pyogenes CRISPR-Cas9. Streptococcus pyogenes è la specie batterica su cui si basa CRISPR-Cas9 e la maggior parte della ricerca successiva che utilizza CRISPR.

Secondo Rodolphe Barrangou, professore di Scienze Alimentari, Bioprocessi e Nutrizione alla NC State:

“Esiste molta più diversità di sistemi CRISPR-Cas in natura di quanto la gente apprezzi, e può essere molto utile estrarre effetti diversi con potenziale funzionale come macchine molecolari.”

Diversi anni prima che il documento sulla tecnologia ricevesse il Premio Nobel, Barrangou aveva caratterizzato CRISPR come un sistema di difesa nei batteri utilizzati nei culture starter lattiero-casearie, e da allora il suo laboratorio ha esplorato la sua diversità per probiotici, produzione alimentare, editing dei genomi degli alberi e alterazione delle proprietà del legno.

Barrangou ha dichiarato quanto segue riguardo alla ricerca più recente:

“Mentre alcuni effetti consolidati come SpyCas9 hanno già mostrato grande potenziale in clinica, dobbiamo espandere la cassetta degli attrezzi CRISPR per la manipolazione di nuova generazione del genoma, del trascrittoma e dell’epigenoma.” 

Ha sviluppato un programma chiamato “CRISPRdisco”, che identifica i sistemi CRISPR-Cas all’interno di grandi database di genomi batterici. Il programma ha aiutato i ricercatori a identificare oltre 1000 diversi sistemi CRISPR inesplorati.

I ricercatori hanno ridotto quei sistemi a soli 50 candidati per il laboratorio di Gersbach da ingegnerizzare.

Testando questi sistemi CRISPR nelle cellule umane per le loro capacità come attivatori genici, repressori e editor genetici ed epigenetici, quattro sistemi si sono distinti per i loro successi individuali.

Uno (SubCas9) è stato particolarmente notevole per la sua versatilità. Questo promettente componente CRISPR si trova nel batterio Streptococcus uberis, comunemente presente nelle mucche da latte ed è anche usato in alcuni prodotti probiotici umani.

I ricercatori sono entusiasti di SubCas9 per diversi motivi. Per cominciare, le piccole dimensioni del nuovo sistema — più piccole del tradizionale scalpello molecolare di DNA Cas9 — ne facilitano la consegna nelle cellule umane. 

Inoltre, può mirare a sequenze geniche uniche inaccessibili ad altri sistemi, incluso il corrispondente originale. 

Il Cas9 tipicamente usato funziona su target genomici adiacenti alla sequenza DNA ‘GG’, che è “una sequenza DNA piuttosto comune”. Tuttavia, se un GG non è vicino, è necessario un’alternativa, e il nuovo sistema la offre lavorando su siti vicini ai pattern “AATA” o “AGTA”.

“Questo sistema può dare ai ricercatori flessibilità nell’uso di diversi Cas9 quando hanno bisogno di essere davvero precisi nella selezione del sito target.”

– Gabe Butterfield, ricercatore postdoc nel Laboratorio Gersbach

Inoltre, è meno probabile che venga riconosciuto dal sistema immunitario umano poiché S. uberis non è solitamente presente negli esseri umani. Questo è diverso dalle specie batteriche, che sono usate per isolare le proteine Cas9 più comuni. 

Quindi, se usato in un’applicazione terapeutica, il sistema immunitario della maggior parte delle persone non riconoscerebbe SubCas9 da una precedente esposizione naturale.

“Oltre al potenziale per applicazioni terapeutiche, apprezziamo anche che i batteri adattati a habitat diversi ospitino effetti più adatti a vari tipi di ospiti, con grande potenziale per la scoperta di sistemi più adatti a piante, bestiame e applicazioni ambientali.”

– Barrangou

Nel passo successivo, i ricercatori esamineranno la capacità di SubCas9 di bypassare l’immunità preesistente come previsto. Stanno anche testando l’incorporazione in diverse terapie cellulari e geniche. I ricercatori potrebbero anche tornare ai vasti database metagenomici batterici per trovare altri sistemi CRISPR da investigare.

Nel complesso, i più recenti progressi nell’editing genico CRISPR-Cas9 rappresentano una grande svolta che può migliorare significativamente le tecniche di terapia genica, consentendo trattamenti più precisi ed efficienti per disturbi genetici, tumori e altre malattie. 

Dato il ritmo rapido della ricerca CRISPR, questi nuovi sistemi potrebbero essere integrati nelle applicazioni cliniche entro i prossimi 3-5 anni, in attesa di ulteriori convalide e approvazioni normative.​

Azienda Innovativa

Editas Medicine, Inc.

Editas Medicine (EDIT ) è una società leader nell’editing del genoma focalizzata sullo sviluppo di terapie basate su CRISPR per trattare una gamma di malattie gravi.

È una società di editing del genoma in fase clinica che sviluppa medicinali di editing genico somministrati in vivo, dove il trattamento è iniettato direttamente nel paziente per modificare le cellule all’interno del corpo. Il CEO Gilmore O’Neill, M.B., M.M.Sc, all’inizio di questo mese, condividendo aggiornamenti aziendali, ha dichiarato:

“Il nostro obiettivo e la nostra strategia per diventare leader nell’editing genico in vivo si sono accelerati nel quarto trimestre dopo aver raggiunto una prova di concetto preclinica in vivo in anticipo rispetto al programma e aver condiviso dati preclinici in vivo positivi che dimostrano il potenziale della nostra tecnologia di piattaforma di ottenere l’upregulation genica, ovvero l’amplificazione dell’espressione di una proteina esistente per raggiungere livelli clinicamente rilevanti che potrebbero potenzialmente portare a cure attraverso i tessuti con una singola dose.”

Al momento della stesura, le azioni della società con capitalizzazione di mercato di 117 milioni di dollari sono scambiate a 1,41 $, in rialzo dell’11,02 % YTD. Il suo EPS (TTM) è -2,88 e il rapporto P/E (TTM) è -0,48.

All’inizio di questo mese, la società ha riportato i risultati finanziari del quarto trimestre e dell’intero anno 2024. La perdita netta è stata di 45,4 milioni di dollari, o 0,55 $ per azione, molto più alta dei 18,9 milioni registrati nel Q4 2023. 

I ricavi sono diminuiti a 30,6 milioni di dollari, e le spese di ricerca e sviluppo sono aumentate a 48,6 milioni di dollari durante questo periodo.

Alla fine del 2024, la società disponeva di 269,9 milioni di dollari in contanti, equivalenti di cassa e titoli negoziabili, leggermente migliori rispetto al trimestre precedente. Secondo l’annuncio della società, prevede che questi fondi, insieme alle parti trattenute dei pagamenti dovuti ai sensi del suo accordo di licenza con Vertex Pharmaceuticals (VRTX ), finanzieranno sia le spese operative sia le spese in conto capitale fino al secondo trimestre del 2027.

Per l’intero anno 2024, la perdita netta è stata di 237,1 milioni di dollari, o 2,88 $ per azione, i ricavi da collaborazioni sono diminuiti a 32,3 milioni di dollari, le spese di R&S sono aumentate a 199,2 milioni di dollari, le spese generali e amministrative sono aumentate a 72 milioni di dollari, e le spese di ristrutturazione sono state di 12,2 milioni di dollari.

I recenti successi della società includono la dimostrazione di una prova di concetto preclinica (PoC) in topi umanizzati e primati non umani.

Questa CTO Linda C. Burkly, Ph.D., ha dichiarato che dimostra la capacità della società di “ottenere l’editing genico in vivo tramite l’upregulation genica per aumentare il livello di una proteina funzionante al fine di affrontare malattie causate da perdita di funzione o mutazioni dannose.” Ha inoltre condiviso il potenziale della strategia di upregulation genica su più tessuti con il programma ‘plug ‘n play’.

Editas ha anche comunicato di essere sulla buona strada per annunciare un candidato di sviluppo in vivo per le cellule staminali ematopoietiche e le cellule epatiche a metà 2025, e entro la fine dell’anno, intende condividere più dati preclinici in vivo su HSC e fegato.

Nel frattempo, la società ha chiuso il programma reni-cel per trattare la malattia falciforme (SCD) dopo che la sua ricerca estesa non è riuscita a trovare un partner commerciale. Con questa mossa, la società ha avviato misure per ridurre i costi, prevedendo una riduzione del personale del 65%, circa 180 posti di lavoro.

Ultime novità su Editas Medicine, Inc.

Conclusione

Negli ultimi dieci anni, le tecnologie basate su CRISPR hanno rivoluzionato la biotecnologia consentendo l’editing del genoma. Hanno creato nuove e diverse opportunità per la ricerca biomedica, l’editing terapeutico del genoma e dell’epigenoma. 

Tuttavia, gli approcci attuali presentano limitazioni a causa del loro focus sproporzionato su un singolo effetto Cas9 con efficienza selettiva e specificità di targeting limitata. 

La scoperta di nuovi sistemi CRISPR-Cas segna un importante avanzamento nell’editing genico. Espandendo precisione, efficienza e versatilità delle tecnologie attuali, lo studio più recente promette trattamenti più mirati per i disturbi genetici e risultati agricoli migliorati. Con i ricercatori che affinano questi sistemi, una volta adottati nella pratica, la prossima generazione di editing genico potrebbe aprire nuove frontiere nella medicina e nella biotecnologia!

Clicca qui per un elenco delle principali aziende CRISPR in cui investire.