Yeni CRISPR Sistemleri Keşfedildi, Gen Düzenleme Hassasiyetini Artırıyor

İnsanların fiziksel ve biyolojik özellikleri genler, gen düzenlemesi, çevre ve gelişim süreçlerinin birlikte etkisiyle oluşur. Genler önemli bir rol oynar, ancak davranış ve zihinsel özellikleri tek başına belirlemez.

Genler ebeveynlerden çocuklara aktarılan DNA dizileridir. Proteinler veya düzenleyici RNA’lar için bilgi taşıyabilir ve özellikleri olasılıksal biçimde etkiler.

Bazı hastalıklar tek bir gendeki patojenik varyanttan kaynaklanır; birçoğu ise çok sayıda gen, çevre ve yaşam koşullarının birleşimiyle ortaya çıkar. Bu nedenle “hatalı genler bütün hastalıklardan sorumludur” şeklindeki basit açıklama doğru değildir.

Genom düzenleme, DNA’da hedeflenmiş değişiklikler yapmaya çalışan yöntemleri kapsar. Belirli bir diziyi kesmek, değiştirmek, susturmak veya düzenlemek mümkün olabilir; ancak hedef dışı değişiklik, eksik düzenleme, hücreye ulaştırma ve bağışıklık yanıtı gibi riskler vardır.

Hedefli DNA değişiklikleri hücre işlevini veya hastalıkla ilişkili yolları etkileyebilir. Sonuç, değişikliğin yerine, hücre tipine, mozaik oranına ve genin biyolojik rolüne bağlıdır.

Genom düzenleme, bazı kalıtsal hastalıklar için tedavi geliştirmede, gen işlevini araştırmada ve bitki ıslahında kullanılır. CRISPR-Cas9, bakterilerin ve arkelerin doğal savunma sistemlerinden uyarlanmış en bilinen platformlardan biridir.

CRISPR dizileri ve Cas proteinleri, prokaryotlarda bazı virüslere ve hareketli genetik öğelere karşı kazanılmış bağışıklık sağlar. Rehber RNA hedef diziyi tanır, uygun Cas proteini ise bağlama veya kesme işlevini yürütür.

Mühendislik ürünü CRISPR-Cas9 sisteminde rehber RNA hedefi belirler, Cas9 ise uygun PAM dizisinin yanında DNA’yı kesebilir. Önceki bazı yöntemlere göre programlanması daha kolaydır; buna rağmen her hedefte daha kesin, daha güvenli veya daha verimli olduğu varsayılamaz.

CRISPR-Cas9 ile genom düzenleme yönteminin geliştirilmesi 2020 Kimya Nobel Ödülü’yle onurlandırıldı. Ödül Emmanuelle Charpentier ve Jennifer Doudna’ya verildi; bu, Nobel bilim ödüllerinden birinin yalnızca iki kadına ilk kez verilmesiydi.

CRISPR ve modern biyolojide genom düzenleme

CRISPR tekrar dizileri ilk kez 1987’de Yoshizumi Ishino ve ekibinin E. coli genomunu incelemesi sırasında raporlandı. Bu dizilerin prokaryotik bağışıklıktaki rolü 2000’ler boyunca deneysel olarak açıklandı.

Son yıllarda CRISPR araçları araştırma, tarım ve bazı tedavilerde hızla ilerledi. Bununla birlikte platformların olgunluğu, güvenliği ve düzenleyici durumu uygulamaya göre değişir.

CRISPR-Cas9 insan embriyolarında araştırma amacıyla kullanıldı ve 2018’de kalıtsal düzenlenmiş bebeklerin doğduğu etik dışı bir deney büyük tepki çekti. Kalıtsal insan genom düzenlemesi birçok ülkede yasaklanmış veya sıkı biçimde sınırlandırılmıştır; somatik hücre tedavileriyle aynı kategoriye konmamalıdır.

CRISPR tabanlı somatik hücre tedavileri bazı kan hastalıkları için düzenleyici onay aldı. Bu başarı, tüm hastalıklar için aynı güvenlik veya etkinliğin sağlandığı anlamına gelmez.

Bu yılın ilk üç ayında, birkaç araştırmacı CRISPR’u kullanarak çeşitli atılımlar gerçekleştirdi.

Colossal Biosciences araştırmacıları uzun tüy, renk ve doku ile ilişkili birden fazla gende düzenleme yaparak “yünlü fareler” üretti. Fareler yünlü mamut değildir ve çalışma nesli tükenmiş bir türü geri getirdiğini göstermez; seçilmiş dış özelliklere yönelik bir kavram kanıtıdır.

Şirket mamut, dodo ve Tazmanya kaplanı gibi türlerle ilişkili projeler yürütüyor. Yaklaşım, yaşayan akraba türlerin hücrelerinde seçilmiş genetik özellikleri değiştirmeyi içeriyor; ortaya çıkabilecek hayvanlar soyu tükenmiş türlerin genetik ve ekolojik açıdan özdeş kopyaları olmayacaktır.

MIT McGovern Enstitüsü ile Broad Enstitüsü araştırmacıları, TIGR-Tas adı verilen¹ eski ve RNA güdümlü DNA hedefleme sistemlerini tanımladı. Kompakt ve modüler yapıları genom düzenleme araçlarını genişletebilir, ancak tedavi ulaştırmasını gerçekten kolaylaştırmaları henüz klinikte gösterilmedi.

TIGR sistemleri laboratuvarda farklı DNA dizilerini hedefleyecek şekilde programlanabilen Tas proteinleri ve tandem aralıklı rehber RNA’lar kullanır. “Herhangi bir DNA dizisini” hedefleme iddiası PAM, yapı ve hücresel bağlam kısıtlarını göz ardı eder.

Daha önce bakteriyel CRISPR sistemlerini genom düzenleme araçlarına uyarlayan ve çeşitli programlanabilir proteinler bulan MIT profesörü Feng Zhang, sistemi şöyle değerlendirdi:

“Bu, çok çeşitli işlevleri bulunan, oldukça çok yönlü bir RNA güdümlü sistem.”

Ekip, RNA rehberine bağlanan yapısal motiflerden yola çıkarak 20.000’den fazla aday Tas proteini belirledi ve seçilmiş örnekleri deneysel olarak test etti. Bazı proteinler insan hücrelerinde hedefli DNA kesimi yapabildi; kapsamlı güvenlik, hedef dışı etki ve ulaştırma çalışmaları henüz gereklidir.

Başka bir laboratuvar çalışması, Down sendromundan türetilen hücre dizilerinde CRISPR-Cas9 kullanarak fazladan 21. kromozomun belirli kopyasını ortadan kaldırmayı araştırdı. Bazı hücrelerde gen ifadesi kalıpları düzeldi, ancak bu bir insan tedavisi veya klinik iyileşme değildir.

Down sendromu, 21. kromozomun tamamının veya bir bölümünün fazladan kopyasından kaynaklanır ve yaklaşık her 700 doğumdan birini etkiler. Klinik tanı ve destek mümkündür, fakat kromozomu vücuttaki çok sayıda hücreden güvenli biçimde kaldıran onaylı bir tedavi yoktur.

Çalışma, pluripotent kök hücrelerde ve deri fibroblastlarında fazladan kromozomun ebeveyn kökenine göre seçici kaybını göstermeye çalıştı. Düzenleme her hücrede gerçekleşmedi ve kromozom kaybı genom kararlılığı ile hedef dışı etkiler bakımından dikkatle değerlendirilmelidir.

Yöntem canlı bir organizmada, beyin dokusunda veya hastalarda kullanıma hazır değildir. Nöron ve glia hücrelerine uygulanabileceği yönündeki ifadeler gelecekteki araştırma önerileridir.

Bitki araştırmacıları, viral vektörler ve mRNA kullanarak yabancı DNA’nın bitki genomuna kalıcı olarak eklenmesini azaltan düzenleme sistemleri geliştirdi. “Dang gibi ölümcül virüsleri kullanmak” ifadesi yanıltıcıdır; kullanılan araç, bitki hücrelerine ulaştırma için mühendislik yapılmış bir viral sistemdir ve insanlarda dang enfeksiyonu oluşturmayı amaçlamaz.

Araştırma ekibine göre optimize edilmiş mRNA ulaştırma yaklaşımı, bitkilerde transgen içermeyen düzenleme seçeneklerini genişletebilir. Verim, tür, doku ve hedefe göre değişir.

Genom düzenleme bitki araştırmasını ve ıslahını hızlandırabilir, ancak verim, tat, kuraklık direnci ve diğer özellikler çoğunlukla çok sayıda gen ile çevrenin etkileşimine bağlıdır. Teknoloji tarımdaki düzenleme, kabul ve ekolojik riskleri ortadan kaldırmaz.

Johns Hopkins ve Cold Spring Harbor araştırmacıları, domatesgillerde meyve büyüklüğünü etkileyen gen ağlarını inceledi. CRISPR deneyleri belirli gen kombinasyonlarının meyve özelliklerini değiştirebildiğini gösterdi; sonuçlar otomatik olarak daha lezzetli veya tüm ürünlerde daha büyük meyve anlamına gelmez.

Çalışma, domates, patates ve patlıcan gibi 22 itüzümü türünün genomlarını karşılaştıran daha geniş bir girişimin parçasıdır. Amaç, evrimsel değişimleri ve ıslah için olası hedefleri anlamaktır.

“Gen düzenlemesini yaptıktan sonra bir tohum, değişikliğin sonraki nesillere aktarılması için yeterli olabilir.”

— Michael Schatz, Johns Hopkins Üniversitesi

Bu çalışmalar genom düzenleme araçlarının çeşitlendiğini gösteriyor. Duke ve North Carolina State Üniversitesi araştırmacıları da insan hücrelerinde test etmek üzere yeni Cas9 ortologları tanımladı.

CRISPR-Cas9 hakkında tüm bilgileri öğrenmek için buraya tıklayın. 

Yeni CRISPR sistemleri hedef aralığını genişletebilir

CRISPR-Cas sistemleri prokaryotlarda çok çeşitlidir. Ortologlar ortak atadan gelen, farklı türlerde karşılıkları bulunan gen veya proteinlerdir; aynı işlevi tam olarak korumaları şart değildir.

CRISPR-Cas sistemleri sınıf, tip ve alt tiplere ayrılır. Tip II sistemlerde Cas9 efektörü kullanılır ve bu grup biyoteknolojide en yaygın araçlardan biridir. Sınıflandırma yeni diziler bulundukça güncellenir; “altı tip ve 33 alt tip” sabit bir nihai sayı değildir.

Cas9’un rehber RNA değiştirilerek yeniden programlanabilmesi, yaygınlaşmasını sağladı. Buna rağmen PAM gereksinimi, hedef dışı kesim, immünojenisite ve hücreye ulaştırma gibi sınırlamalar tedavi geliştirmeyi zorlaştırır.

Doğada çok sayıda Cas9 bulunmasına rağmen yalnızca bir kısmı insan hücrelerinde yeterli aktivite ve uygun özgüllük gösterir. Bu, CRISPR’ın tüm potansiyelini ortadan kaldırmaz; farklı uygulamalar farklı proteinler, baz düzenleyiciler veya prime editing gibi sistemler kullanabilir.

Yeni Cas9 ortologları hedeflenebilir PAM dizilerini genişletebilir, daha küçük paketlere sığabilir veya belirli hedeflerde farklı etkinlik ve özgüllük sağlayabilir. Bu özelliklerin hiçbiri yalnızca diziden hareketle garanti edilemez.

Duke ve NC State ekipleri binlerce bakteri genomunu tarayarak aday CRISPR-Cas sistemleri belirledi, ardından seçilmiş proteinleri mühendislik ve insan hücresi deneyleri için daralttı.

Proceedings of the National Academy of Sciences’ta yayımlanan çalışma², araştırma amaçlı genom ve epigenom düzenleme araçlarını genişletebilecek adaylar sundu. Klinik veya tarımsal etki henüz gösterilmiş değildir.

“İnsan hücrelerinde kullanılan ilk CRISPR-Cas sistemlerinin hâlâ en iyi çalışanlar arasında olması dikkat çekici. Daha az incelenen ortamlardaki bakterileri tarayarak farklı yeteneklere sahip olabilecek sistemler bulmak istedik.”

— Charlie Gersbach, Duke Üniversitesi

Adaylar arasında, sığırlarda mastitle ilişkili olabilen Streptococcus uberis kaynaklı SubCas9 insan hücresi deneylerinde ilgi çekti. Kaynağın süt ineklerinde bulunması bu proteini otomatik olarak insan sağlığı için güvenli veya terapötik yapmaz.

SubCas9 farklı PAM dizilerini tanıyarak SpyCas9’un erişemediği bazı hedefleri tamamlayabilir. Buradaki “ortogonal” kullanım, araçların farklı hedefleme gereksinimlerine sahip olmasını anlatır; insan genomundaki her dizinin esnek biçimde hedeflenebildiği anlamına gelmez.

Seçilmiş deneylerde SubCas9 aktivitesi yaygın kullanılan Streptococcus pyogenes Cas9 ile karşılaştırılabilir düzeydeydi. Bu sonuç belirli hücreler ve hedefler içindir; özgüllük, hedef dışı kesim ve farklı dokulardaki verim ayrıca ölçülmelidir.

NC State Üniversitesi profesörü Rodolphe Barrangou şöyle dedi:

“Doğadaki CRISPR-Cas çeşitliliği çok daha fazladır; işlevsel potansiyeli bulunan farklı efektörleri moleküler makineler olarak araştırmak çok yararlı olabilir.”

Barrangou ve çalışma arkadaşları daha önce CRISPR’ın süt ürünleri starter kültürlerinde fajlara karşı savunmadaki rolünü göstermişti. Laboratuvarı daha sonra gıda mikroorganizmaları, probiyotikler, bitkiler ve ağaç özellikleri gibi alanlarda CRISPR çeşitliliğini araştırdı.

Barrangou son çalışma hakkında şunları söyledi:

“SpyCas9 gibi bazı mevcut efektörler klinikte büyük potansiyel göstermiş olsa da, genomu, transkriptomu ve epigenomu yeni nesil yöntemlerle değiştirmek için CRISPR araç kutusunu genişletmemiz gerekiyor.”

Ekip, büyük bakteri genomu veri tabanlarında CRISPR-Cas sistemleri arayan “CRISPRdisco” yazılımını kullandı ve binden fazla aday sistem belirledi. “Keşfedilmemiş” sözcüğü bunların tamamının deneysel olarak işlevsel olduğu anlamına gelmez.

Araştırmacılar adayları dizi, boyut ve diğer ölçütlerle yaklaşık 50 sisteme indirdi; Gersbach laboratuvarı bunların seçilmiş örneklerini mühendislik ve hücre deneylerinde değerlendirdi.

İnsan hücrelerinde aktivatör, baskılayıcı, genom ve epigenom araçları olarak yapılan testlerde dört sistem belirli işlevlerde öne çıktı. Sonuçlar erken araştırma düzeyindedir ve hayvan veya insan tedavisi başarısı değildir.

SubCas9 küçük boyutu, farklı PAM tercihi ve çeşitli mühendislik görevlerindeki aktivitesi nedeniyle dikkat çekti. Kaynak bakterinin bazı probiyotik ürünlerle ilişkilendirilmesi, proteinin klinik güvenliğine dair kanıt oluşturmaz.

SubCas9’un SpyCas9’dan daha küçük olması, viral vektör gibi sınırlı taşıma kapasitesine sahip platformlarda avantaj sağlayabilir. Daha küçük boyut tek başına hücreye daha kolay, daha güvenli veya daha etkili ulaştırma garantisi değildir.

Sistem, SpyCas9’un PAM gereksinimi nedeniyle erişemediği bazı dizileri hedefleyebilir ve böylece iki aracın hedef aralıkları kısmen birbirini tamamlar.

SpyCas9 çoğunlukla NGG PAM dizisinin yanındaki hedeflerde çalışır. SubCas9 ise çalışmada AATA veya AGTA gibi PAM motiflerini tercih etti; bu, belirli hedefler için seçenek sağlar ancak tüm dizileri erişilebilir kılmaz.

“Bu sistem, hedef bölge seçiminde çok hassas olunması gerektiğinde araştırmacılara farklı Cas9’lar kullanma esnekliği sağlayabilir.”

— Gabe Butterfield, Gersbach Laboratuvarı

S. uberis insanlarda yaygın kolonizan bir bakteri değildir; bu nedenle SubCas9’a karşı önceden var olan bağışıklığın bazı yaygın Cas proteinlerinden daha düşük olabileceği öne sürüldü. Bu hipotez insan örneklerinde geniş biçimde ölçülmeden kesinleştirilemez.

Çoğu kişinin SubCas9’u tanımayacağı varsayımı henüz klinik olarak doğrulanmamıştır. Antikor ve T-hücresi yanıtları geçmiş maruziyet, çapraz reaktivite, doz ve ulaştırma yöntemine göre değişebilir.

“Terapötik olasılıkların yanı sıra, farklı habitatlara uyum sağlamış bakterilerin farklı konaklara daha uygun efektörler taşıyabileceğini ve bitki, hayvan ve çevresel uygulamalar için sistemler bulma potansiyelini görüyoruz.”

— Rodolphe Barrangou

Araştırmacılar SubCas9’a karşı önceden var olan bağışıklığı, hedef dışı etkileri ve farklı hücrelerdeki performansı incelemeyi planlıyor. Ayrıca yeni adaylar için daha büyük metagenom veri tabanlarını tarayacaklar.

Yeni Cas sistemleri araştırma araçlarını genişletebilir ve gelecekte tedavilere katkı sağlayabilir. Ancak çalışma insan hücrelerinde erken aşamadadır; genetik hastalıklar veya kanser için daha güvenli ve etkili tedaviler sağladığı henüz gösterilmemiştir.

Bu sistemlerin üç ila beş yıl içinde klinik uygulamaya gireceğini öngörmek için yeterli veri yoktur. Optimizasyon, hayvan çalışmaları, üretim, toksikoloji, klinik deneyler ve düzenleyici inceleme süreleri hedefe göre büyük ölçüde değişir.

İlgili şirket

Editas Medicine, Inc.

Editas Medicine (EDIT ), CRISPR tabanlı ilaçlar geliştiren klinik aşama bir genom düzenleme şirketidir. Şirket 2024 sonunda odağını hücre dışında düzenlenen reni-cel programından, doğrudan vücutta uygulanan erken aşama in vivo platformlara kaydırdı.

İn vivo düzenlemede tedavi bileşenleri hastaya verilerek vücuttaki belirli hücrelere ulaştırılmaya çalışılır. Bu yaklaşımın Editas için klinik olarak doğrulandığı anlamına gelmez; aşağıdaki açıklama, CEO Gilmore O’Neill’ın 2024 sonuçları sırasında yaptığı şirket değerlendirmesidir:

“Hedefimiz ve stratejimiz, planlanandan önce in vivo preklinik kavram kanıtına ulaşmamız ve mevcut bir proteinin ifadesini klinik olarak anlamlı düzeylere çıkarmayı amaçlayan gen yukarı düzenleme platformumuza ilişkin olumlu preklinik veriler paylaşmamız nedeniyle in vivo genom düzenlemede lider konuma gelmekti. Bu yaklaşımın tek dozla farklı dokularda yarar sağlama potansiyeli olabilir.” Bu sözler preklinik şirket hedeflerini anlatır, hastalarda gösterilmiş yararı değil.

Kaynak yazı, Editas’ın o tarihteki piyasa değeri ve hisse fiyatını veriyordu. Bu rakamlar hızla değiştiği ve negatif kazançlı bir şirkette negatif fiyat/kazanç oranı anlamlı olmadığı için burada yatırım kanıtı olarak kullanılmamıştır.

Şirketin 2024 dördüncü çeyrek ve tam yıl sonuçlarına göre çeyreklik net zarar 45,4 milyon dolar veya hisse başına 0,55 dolardı; 2023’ün aynı çeyreğinde zarar 18,9 milyon dolardı.

Dördüncü çeyrek geliri 30,6 milyon dolar, Ar-Ge gideri ise 48,6 milyon dolardı. Lisans ve iş birliği gelirleri dönemsel olabileceği için tek bir çeyrek kalıcı satış eğilimi olarak yorumlanmamalıdır.

2024 sonunda nakit, nakit benzeri ve menkul kıymetler 269,9 milyon dolardı. Yönetim, mevcut kaynakların ve Vertex Pharmaceuticals (VRTX ) lisans ödemelerinin o tarihteki plana göre 2027’nin ikinci çeyreğine kadar işletme ve sermaye harcamalarını finanse edebileceğini söyledi. Nakit ömrü harcama, ödeme ve program kararlarıyla değişebilir.

2024 tam yıl net zararı 237,1 milyon dolar veya hisse başına 2,88 dolardı. İş birliği geliri 32,3 milyon dolara gerilerken Ar-Ge gideri 199,2 milyon dolar, genel ve idari giderler 72 milyon dolar, yeniden yapılandırma giderleri 12,2 milyon dolardı.

Şirket, insanlaştırılmış fareler ve insan dışı primatlarda gen yukarı düzenleme için preklinik kavram kanıtı bildirdi. Hayvan verileri güvenlik, doz, dayanıklılık veya insanlar üzerindeki klinik etkinliği kanıtlamaz.

Şirket yöneticileri, kayıp işlev veya zararlı varyantlarla ilişkili hastalıklarda işlevsel protein düzeyini artırmak için in vivo gen yukarı düzenlemeyi hedeflediklerini belirtti. “Tak ve çalıştır” platform iddiası, her hedef ve doku için ulaştırma ve biyoloji sorunlarının çözüldüğü anlamına gelmez.

Şirket 2025 içinde hematopoietik kök hücre ve karaciğer hedefleri için aday seçmeyi ve ek preklinik veri paylaşmayı planlıyordu. Bunlar yazının yayımlandığı tarihte ileriye dönük hedeflerdi; aday seçimi klinik deneme veya onay değildir.

Editas, ticari ortak bulamadıktan sonra orak hücre hastalığı için reni-cel programını durdurdu ve çalışan sayısını yaklaşık %65 azalttığını açıkladı. Bu değişiklik nakdi koruyabilir, ancak ortaklık, finansman, yürütme ve yoğunlaşma risklerini de gösterir.

Editas Medicine ile ilgili son gelişmeler

Sonuç

CRISPR tabanlı yöntemler son on yılda araştırma, tanı, tarım ve bazı somatik hücre tedavilerinde önemli ilerleme sağladı. Onaylı birkaç uygulama, tüm CRISPR platformlarının güvenli, hassas veya klinik olarak hazır olduğu anlamına gelmez.

SpyCas9’un PAM gereksinimi, boyutu, hedef dışı etkileri ve olası bağışıklık yanıtı sınırlamalar yaratır. Bununla birlikte genom düzenleme alanı yalnızca tek Cas9’a dayanmaz; Cas12, baz düzenleme, prime editing ve RNA hedefleyen araçlar da geliştirilir.

Yeni Cas9 ortologlarının keşfi hedef aralığını ve araştırma seçeneklerini genişletebilir. Çalışma henüz klinik tedavi veya tarımsal ürün başarısı göstermedi; gerçek dünyadaki yarar, güvenlik, ulaştırma, üretim, düzenleyici onay ve maliyet verileriyle belirlenmelidir.

CRISPR alanındaki halka açık şirketlere ilişkin ayrı yatırım incelemesine buradan ulaşabilirsiniz.