Τι είναι η CRISPR-Cas12a2 και γιατί έχει σημασία; Τα ευρήματα του 2023

Σύντομη Ιστορία του CRISPR

Το CRISPR είναι το ακρωνύμιο του Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Πρόκειται για επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες στο DNA προκαρυωτικών οργανισμών, όπως βακτήρια και αρχαία. Μαζί με τις πρωτεΐνες Cas αποτελούν μέρος φυσικών συστημάτων άμυνας κατά ξένου γενετικού υλικού. Οι ερευνητές αξιοποίησαν αυτούς τους μηχανισμούς για την ανάπτυξη εργαλείων γονιδιακής επεξεργασίας.

Στην τεχνολογία CRISPR-Cas9, ένα μόριο RNA-οδηγού κατευθύνει την πρωτεΐνη Cas9 σε επιλεγμένη αλληλουχία DNA. Η μέθοδος χρησιμοποιείται για στοχευμένηεπεξεργασία γονιδίων σε ζωντανά κύτταρα και οργανισμούς . Η αλλαγή της αλληλουχίας του οδηγού επιτρέπει την επιλογή διαφορετικού στόχου.

Η μέθοδος διευκολύνει τη στόχευση συγκεκριμένων περιοχών του DNA, χωρίς αυτό να αποκλείει ανεπιθύμητες αλλαγές. Το Νόμπελ Χημείας του 2020 απονεμήθηκε στις Emmanuelle Charpentier και Jennifer A. Doudna για την ανάπτυξη μεθόδου επεξεργασίας του γονιδιώματος. Υπήρχαν και προγενέστερα εργαλεία στοχευμένης επεξεργασίας.

Υπάρχουν διαφορετικές οικογένειες πρωτεϊνών Cas. Η Cas13 στοχεύει RNA και μπορεί να αξιοποιηθεί για την ανίχνευση ή τροποποίησή του σε κατάλληλα συστήματα. Η Cas12a και η Cas12a2 έχουν συγγενείς ονομασίες αλλά σημαντικά διαφορετική δράση. Το άρθρο εξετάζει τα ευρήματα που δημοσιεύθηκαν τον Ιανουάριο του 2023.

Cas12a και Cas9

Για μια απλή σύγκριση, η Cas12a διαφέρει από τη συνήθως χρησιμοποιούμενη Cas9 ως προς τις αλληλουχίες αναγνώρισης, τον τρόπο κοπής του DNA και τις απαιτήσεις του RNA-οδηγού:

• Αναγνωρίζει διαφορετικές αλληλουχίες PAM, επιτρέποντας πρόσβαση σε διαφορετικές θέσεις του DNA.
  • Με απλά λόγια: Ορισμένοι στόχοι που δεν είναι εύκολα προσβάσιμοι με μια μορφή Cas9 μπορεί να είναι κατάλληλοι για Cas12a.
• Η Cas12a δημιουργεί συνήθως κλιμακωτές τομές με προεξέχοντα άκρα, σε αντίθεση με τις συνήθως αμβλείες τομές της Cas9. Αν η θέση αναγνώρισης παραμένει κατάλληλη, μπορεί να ακολουθήσει νέα κοπή.
  • Με απλά λόγια: Ο διαφορετικός τρόπος κοπής μπορεί να βοηθήσει σε ορισμένες εφαρμογές, αλλά δεν εγγυάται γενικά υψηλότερη αποδοτικότητα.
• Η Cas12a δεν απαιτεί ξεχωριστό trans-activating crRNA, δηλαδή tracrRNA, και χρησιμοποιεί μικρότερο RNA-οδηγό. Η δυνατότητα επεξεργασίας συστοιχιών crRNA διευκολύνει τη στόχευση πολλών θέσεων.
  • Με απλά λόγια: Μπορούν να σχεδιαστούν συστήματα Cas12a για ταυτόχρονη επεξεργασία περισσότερων του ενός γονιδίων.

Πηγή: Wikipedia

Οι ιδιαίτερες ιδιότητες της Cas12a2

Η Cas12a επεκτείνει τα εργαλεία στοχευμένης κοπής DNA. Η Cas12a2, παρότι είχε αρχικά συσχετιστεί με την ίδια ομάδα, παρουσιάζει πολύ διαφορετική βιοχημική συμπεριφορά.

Η ονομασία Cas12a2 δεν σημαίνει απλώς μια βελτιωμένη δεύτερη έκδοση της Cas12a. Η αναγνώριση στόχου RNA ενεργοποιεί ευρεία, μη ειδική ως προς την αλληλουχία διάσπαση νουκλεϊκών οξέων.

Τα φυσικά συστήματα CRISPR-Cas συμμετέχουν στην άμυνα μικροοργανισμών. Οι ερευνητές επαναχρησιμοποιούν ορισμένα από αυτά για εργαστηριακά εργαλεία. Η δράση της Cas12a2 διαφέρει από την επιλεκτική κοπή ενός μόνο στόχου DNA. Όταν αναγνωρίζει RNA που αντιστοιχεί στον οδηγό της, ενεργοποιεί διάσπαση RNA, μονόκλωνου DNA και δίκλωνου DNA πέρα από τον αρχικό στόχο. Στα βακτηριακά πειράματα η δράση αυτή ανέστειλε κυρίως την ανάπτυξη των κυττάρων, με ορισμένο κυτταρικό θάνατο, περιορίζοντας τη λοίμωξη. Δεν αποδείχθηκε ότι σκοτώνει πάντοτε κάθε προσβεβλημένο κύτταρο.

Δύο συμπληρωματικές εργασίες στο Nature, που δημοσιεύθηκαν ηλεκτρονικά στις 4 Ιανουαρίου 2023, παρουσίασαν τον μηχανισμό και τη δομική του βάση.

Εφαρμογές του Cas12a2

Η ενεργοποίηση από συγκεκριμένο RNA και η ευρεία επακόλουθη δράση δημιουργούν δυνατότητες ανάπτυξης νέων εργαλείων. Οι προτεινόμενες χρήσεις πρέπει να διακρίνονται από αποδεδειγμένες κλινικές εφαρμογές.

Μία πιθανή ερευνητική χρήση είναι η βελτίωση διαδικασιών γονιδιακής επεξεργασίας μέσω αρνητικής επιλογής: θα μπορούσαν να απομακρύνονται κύτταρα που διατηρούν μια ανεπιθύμητη αλληλουχία. Η πρόταση αυτή δεν αποτελούσε καθιερωμένη γενική μέθοδο για ανθρώπινη θεραπεία.

Μια δεύτερη κατεύθυνση είναι η ανίχνευση συγκεκριμένων στόχων RNA. Η αρχική εργασία παρουσίασε εργαστηριακή απόδειξη της αρχής. Δεν τεκμηρίωνε ένα σχεδόν τέλειο διαγνωστικό τεστ.

Τα μελλοντικά τεστ με Cas12a2 θα μπορούσαν να αξιοποιήσουν το σήμα από τη διάσπαση κατάλληλων μορίων-αναφοράς. Η ευαισθησία, το κόστος, ο εξοπλισμός και η αξιοπιστία πρέπει να μετρηθούν για κάθε τεστ· δεν είχε αποδειχθεί ότι συνδυάζει αυτομάτως την απόδοση PCR με την απλότητα οικιακού τεστ.

Η αλλαγή του crRNA μπορεί να επιτρέψει τη στόχευση διαφορετικών RNA, όπως αλληλουχιών από SARS-CoV-2, ιούς γρίπης, Έμπολα ή Ζίκα. Η COVID-19 είναι νόσος και όχι όνομα ιού. Δεν πρόκειται για μία ενιαία οικογένεια ιών, ούτε για εγγυημένη ανίχνευση κάθε μετάλλαξης.

Η γνώση της αλληλουχίας του στόχου είναι αφετηρία για τον σχεδιασμό οδηγού. Απαιτούνται επίσης βελτιστοποίηση, προετοιμασία δείγματος και έλεγχοι απόδοσης. Η δημιουργία ενός σχεδίου σε λίγες εβδομάδες δεν ισοδυναμεί με την ανάπτυξη επικυρωμένου κλινικού τεστ.

Με βάση τα ευρήματα του Ιανουαρίου 2023, η ανίχνευση RNA ήταν μια εύλογη κατεύθυνση έρευνας που χρειαζόταν περαιτέρω ανάπτυξη.

Μια τρίτη, πιο μακρινή δυνατότητα είναι η αξιοποίηση σε αντικαρκινική έρευνα. Θεωρητικά θα μπορούσε να επιδιωχθεί ενεργοποίηση σε RNA χαρακτηριστικό καρκινικών κυττάρων. Η ασφαλής μεταφορά, η εκλεκτικότητα και η αποφυγή βλάβης σε υγιή κύτταρα είναι ουσιώδη ανεπίλυτα ζητήματα. Οι εργασίες δεν απέδειξαν αποτελεσματική θεραπεία καρκίνου σε ανθρώπους.

Τι σημαίνει για την έρευνα και τις επενδύσεις

Η ανακάλυψη έδειχνε το 2023 ότι υπήρχαν ακόμη διαφορετικοί μηχανισμοί CRISPR προς διερεύνηση. Η Cas12a2 βρισκόταν σε πρώιμη ερευνητική φάση, και η δημοσίευση βασικών ευρημάτων δεν ισοδυναμούσε με εμπορική ετοιμότητα.

Η ανάπτυξή της μπορούσε να δημιουργήσει νέα εργαλεία ανίχνευσης. Το αν θα συμπλήρωνε ή θα ανταγωνιζόταν τεστ αντιγόνων και PCR εξαρτιόταν από μελλοντικά δεδομένα και πραγματικές εφαρμογές.

Άλλες διαγνωστικές τεχνολογίες CRISPR είχαν ήδη μελετηθεί πριν από το 2023, μεταξύ άλλων με Cas12 και Cas13. Η συμβολή της Cas12a2 ήταν ο διαφορετικός μηχανισμός, όχι η πρώτη ιδέα χρήσης CRISPR σε διαγνωστικά τεστ.

Η Editas Medicine (EDIT ) αναπτύσσει τεχνολογίες Cas9 και Cas12a. Αυτό δεν αποδεικνύει ότι διέθετε πρόγραμμα ανάπτυξης Cas12a2. Οι δύο ονομασίες πρέπει να διακρίνονται.